做共培养的你，是否也被这些问题困扰？想看细胞怎么互动，却只能依赖免疫荧光固定染色——操作繁琐不说，还只能得到一张静态“快照”，贴附、融合、细胞穿插、组织重塑这些连续动态全凭脑补；更要命的是，固定、透膜、抗体孵育一套下来，类器官的3D立体构型早已面目全非，原位互作信息无从还原。今天，我们结合两篇CNS重磅论文，为大家介绍一种基于内源荧光整合示踪的全新可视化策略，彻底绕开固定与抗体染色，实现共培养融合全程的活细胞追踪。

简单说下原理：我们预先在iPSC基因组中整合GFP或mCherry等稳定荧光蛋白标签，再将其分别定向分化为目标功能细胞。共培养时，两类细胞自带可区分的荧光信号，无需固定或抗体染色，即可在活细胞层面实时追踪聚集、包裹、融合、血管出芽等完整动态过程，同时支持延时摄影，完整记录时序演变。

一、传统免疫荧光的3大硬伤

1. 检测需要牺牲样本：免疫荧光染色需对样本进行固定处理，属于终末型破坏性检测。样本不可重复使用，迫使研究人员为每个观测时间点重新制备独立样本，显著增加了多时间点实验的重复成本与样本批次间差异带来的不确定性。

2. 静态单帧成像，缺失发育动态全貌：免疫荧光仅限于固定时刻的单点观测，仅能提供某一时间窗内的瞬时融合结果，无法连续记录类器官从贴附、迁移、融合直至管腔连通与组织重塑的完整时序演变过程。

3. 多步操作易损伤3D立体结构：固定、破膜、多轮抗体孵育及反复漂洗等繁复流程，极易对类器官的3D立体结构造成机械与化学损伤，破坏其原生空间排布与细胞间天然组织形态。这使得最终获取的图像数据难以真实还原共培养体系内细胞互作的原位空间组织特征。

二、对比传统染色的核心优势

1. 活细胞动态观测：培养箱延时显微镜连续记录融合全过程，捕捉细胞迁移、管腔贯通动态；

2. 无样本损伤：无需固定通透，完整保留 3D 类器官立体结构与生理功能；

3. 边界清晰无背景：内源荧光特异性标记细胞本体，不存在一抗非特异结合、染料渗漏干扰；

4. 可定量分析：直接统计红绿融合占比、融合区域面积、分区空间分布，批量自动化量化。

三、两个实操案例：共培养效果直观展示

案例1：通过延时成像与多通道荧光示踪，系统展现了iPSC来源肝芽类器官的体外自组装全过程。图中可清晰辨识三个关键阶段：微孔内细胞均匀接种、迁移后分层自组织，以及最终形成具有完整三维结构的成熟肝芽类器官，完整复现了从单细胞离散态到组织态类器官的构建路径。（2017 Cell Reports）

注：tHE，transitional hepatic endoderm；EC，endothelial cells；STM，septum transversum mesenchyme

案例2：将mCherry-iPSC和GFP-iPSC分别定向分化为Zone1样（门静脉）和Zone3样（中央静脉）肝类器官。共培养后，二者通过细胞骨架重塑与融合，自发组装为同时具备门周与中央区空间特征的多分区肝类器官。明场及荧光成像直观验证了类器官从初始接触到完全融合的全过程及融合效率。（2025 Nature）

四、全文总结

基于内源荧光的示踪技术为多谱系共培养类器官研究提供了一种无损伤、可动态、可定量的可视化方案。它打破了传统固定染色只能拍 “静态快照” 的局限，让我们能完整追踪多细胞自组装的全过程，也为解析类器官分区形成、细胞互作等关键科学问题，提供了更真实、更高效的研究手段。

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参考文献

1. 10.1016/j.celrep.2017.11.005

2. 10.1038/s41586-025-08850-1